葡萄糖激酶基因及包装细胞系的构建上是嘛

葡萄糖激酶基因及包装细胞系的构建(上)

提 要: 目的 构建葡萄糖激酶(glucokinase , GK) 基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系,为将GK基因应用于糖尿病的基因治疗打下基础。方法 质粒pCMV42GKZ1 经EcoR ⅠPBamH Ⅰ双酶切后亚克隆至逆转录病毒载体PLXSN ,构建成重组逆转录病毒表达载体PLX2GK,采用酶切及测序对重组体进行鉴定。而后脂质体转染PLX2GK至包装细胞PA317 ,检测培养上清病毒滴度,挑选滴度较高的稳定产毒细胞系并对其行PCR 及免疫组化鉴定。结果 构建了GK基因逆转录病毒表达载体PLX2GK,经酶切及序列分析证实目的基因插入位点和读码框架正确、无突变;建立了稳定产毒细胞系PA317PGK,其培养上清平均病毒滴度为6. 8 ×105 cfuPml ,最高为1. 8 ×106 cfuPml ,PCR 及免疫组化证实GK基因整合入PA317PGK细胞基因组并有GK的表达。结论 成功构建了携GK基因的逆转录病毒表达载体及高滴度的稳定产毒细胞系。

关键词: 葡萄糖激酶基因;逆转录病毒载体

糖尿病是由遗传和环境因素相互作用而引起的一种疾病,由于其发病机制尚未完全明了,目前其治疗仍以胰岛素替代疗法为主。但2、实验机测控环节的影响随着对糖尿病分子生物学研究的深入,人们对基因在糖尿病发病中的作用有了更多的认识,这就使糖尿病的基因治疗成为一种可能,也为糖尿病的治疗带来新的希望。葡萄糖激酶(glu2cokinase ,GK) 是一种己糖激酶,其基因位于第7 号染色体短臂上,目前已经证实GK基因突变是青年发病的成年型糖尿病(maturity2onset diabetes of the young ,MODY) 发生最重要的原因1 。研究还表明在糖尿病个体中普遍存在着GK活性下降,改善其活性,可逆转糖尿病的糖、脂等代谢紊乱2 。为了进一步阐明GK基因与糖尿病的联系,并最终将其应用于糖尿病的基因治疗不适用成品和薄片,我们先行构建了GK基因逆转录病毒表达载体及稳定的产毒细胞系。

1 材料和方法

111 材料

Rat GK质粒(pCMV42GKZ1) 、抗鼠GK IgG由Dr M. gnu2

son 惠赠(Vanderbilt University Medical School) ,逆转录病毒载体

PLXSN 由第三军医大学微生物学教研室蹇锐博士惠赠。包装细胞PA317、NIH3T3 细胞来自第三军医大学微生物学教研室。脂质体Lipofectamine2000购自Invitrogen 公司,DNA 限制性内切酶EcoR Ⅰ、BamH Ⅰ,T4 连接酶, Taq 酶购自华美生物工程公司,DMEM、G418 购自Gibco 公司,质粒抽提及回收试剂盒购自上海申友公司,S2P 免疫组化试剂盒购自中山公司。

112 方法

1.2. 1 GK 基因重组逆转录病毒载体的构建

EcoR ⅠPBamH磨擦实验机构造原理 Ⅰ双酶切质粒pCMV42GKZ1 和逆转录病毒载体PLXSN ,将BamH Ⅰ2GKcDNA2 EcoR Ⅰ片段亚克隆到双酶切逆转录病毒载体上,构建成重组载体PLX2GK。EcoR ⅠPBamH Ⅰ双酶切、单酶切鉴定,TaKaRa 公司ABI 测序仪鉴定。

1. 2. 2 重组逆转录病毒的包装、筛选

转染前,先用荧光载体pEGFP2N2 转染PA317 细胞,观察转染效率。PA317 细胞经HAT(H:1 ×10 - 4 molPL ;A:4 ×10- 7 molPL ; T:1. 6 ×10 - 5 molPL) 筛选,以脂质体Lipofectamine2000转染重组逆转录病毒载体(PLX2GK)至包装细胞PA317 ,3d 后加G418 选择培养液(1 mgPml) 筛选,直至可见细胞克隆,用克隆环挑取分隔良好的细胞克隆扩大培养。

1. 2. 3 病毒滴度测定

移出各细胞克隆培养液倍比稀释后加入6 cm培养皿中NIH3T3 细胞上,加Polybrene 至终浓度8μgPml ,37 ℃、5 %CO2 培养5 h ,补加DMEM至Polybrene 终浓度2μgPml 培养48 h。然后将细胞1∶10 分传入G418贮油罐内的油是不是加满 选择培养液(1 mgPml) 中,直至可见细胞克隆,倒置显微镜下计算克隆形成数,计算病毒滴度。

1. 2. 4 产毒细胞系的鉴定

提取病毒滴度最高的产毒细胞基因组DNA ,用大鼠GK特异性引物行PCR 扩增,同时对该细胞中GK表达行S2P 免疫组化鉴定,均分别以转入空载体(PLX2SN) 的PA317 细胞作对照。

(待续)